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84農業(yè)網 時間：2018-03-14 作者：佚名 來源：網絡整理
植物病毒病是危害農作物的一類重要病害，因其危害大、防治困難而有植物癌癥之稱。近年來，植物病毒病在果樹、蔬菜、花卉以及多種經濟作物上的危害越來越嚴重。大量研究證明，植物病毒病多數是由煙草花葉病毒（TMV）和黃瓜花葉病毒（CMV）引起的。黃瓜花葉病毒能侵染1000多種單、雙子葉植物，可經75種蚜蟲傳播，有些分離物還可通過種子傳播，是寄主植物最多、分布最廣、最具經濟重要性的植物病毒之一。能引起多種蔬菜產生花葉、壞死、枯萎等，為害面積大。為了減輕其在生產上的危害，多年來科研工作者嘗試了多種不同方法防治CMV，提出了不同的防治策略。本文擬對相關內容進行探討，以尋求高效的黃瓜花葉病毒防治策略。
1黃瓜花葉病毒（CMV）概述
1.1CMV分類及危害
黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）屬雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus）的典型成員。白Doolittle和Jagge分別報道CMV是黃瓜花葉病的病原以來，各國學者相繼報道了CMV的危害。近10多年來，CMV在一些國家和地區(qū)的許多作物上造成嚴重危害，如引起番茄的壞死、香蕉的花葉（心腐）、豆科植物的花葉、瓜類的花葉、西番蓮的死頂等。此外，許多過去被認為是新的病毒，現已被證實為CMV新的株系。幾十年來，各國學者根據他們分離到的CMV的寄主范圍及癥狀表現得到許多株系或分離物，迄今，全世界已報道了100多個CMV株系（如Fny、Y、O、NT9、lx、Q）或分離物。
1.2CMV微觀結構及RNA組成
黃瓜花葉病毒為直徑約29nm的二十面體的小顆粒，顆粒分子量約為5.3×10E6，其中18%是RNA，82%是蛋白質。CMV是單鏈RNA病毒，屬三分體基因組，包括4個RNA片段，即RNA1～4，其分子量分別為1.01×10E6、0.89×10E6、0.68×10E6、0.33×10E6。RNA1～3的長度分別為3.3×10E3b、3.2×10E3b、2.2×10E3b。RNA1和RNA2分別編碼111×10E3D和97×10E3D2個蛋白，RNA3含編碼3a蛋白基因和外殼蛋白（CP）基因，編碼一個移動蛋白（即3a蛋白，30×10E3D）和一個外殼蛋白（24×10E3D）。1976年美國農業(yè)部研究中心的Kaper等發(fā)現，有些CMV中除含有病毒本身的4段RNA外，還有一種分子量更小的RNA5（1×10E5），稱為衛(wèi)星RNA5。研究發(fā)現衛(wèi)星RNA不能獨立侵染和復制，完全依賴于CMV的輔助作用，但衛(wèi)星RNA能干擾CMV復制，降低CMV濃度。
2黃瓜花葉病毒防治策略研究進展
2.1藥劑防治
由于植物病毒對植物細胞的絕對寄生性，病毒復制所需要的物質、能量、場所等完全由寄主提供，而且植物沒有動物那樣完整的免疫代謝系統(tǒng)，給高選擇性的化學抗病毒制劑的研究與開發(fā)以及植物病毒病的防治帶來很大的困難，至今尚無有效的抗病毒治療劑。
黃瓜病毒病的發(fā)生與蚜蟲的發(fā)生情況密切相關。蚜蟲是CMV傳播的主要媒介，一般蚜蟲密度高，CMV的發(fā)病率也高，蚜蟲密度低，CMV的發(fā)病率也低。特別是高溫干旱天氣可促進蚜蟲的繁殖和傳毒。因此利用藥劑殺死蚜蟲，可有效切斷傳播途徑，達到防治CMV的目的。但目前生產上使用的防治蚜蟲的藥劑多數是劇毒農藥，如氧化樂果、甲胺磷等，一些生物農藥防治效果不很理想。因此，通過使用農藥防治蚜蟲不僅污染環(huán)境，而且提高農業(yè)成本投入和降低產品質量安全系數。
2.2黃瓜花葉病毒疫苗的研制
田波等把CMV基因組RNA和衛(wèi)星RNA按1∶1的比例混合，接種到多種植物上，選取無致病力的分離物，組建成CMV生物防治制劑（疫苗）S51、S52，該制劑可使青椒和番茄病情指數降低50%左右，果實增產30%左右。此外，它還具有促進果實早熟和降低真菌病害危害的作用，在生產上曾有一定應用面積。疫苗的應用雖具有無公害的優(yōu)點，但其防治效果不夠穩(wěn)定，易受環(huán)境條件影響。
2.3篩選具有抗CMV基因的種質資源，選育抗病新品種
對現有的栽培種和野生種進行接種鑒定，篩選具有抗（耐）CMV的種質資源，運用雜交育種和系統(tǒng)選育的方法選育獲得了一些抗（耐）CMV的煙草、番茄、辣椒新品種和品系。這種方法育種周期長，效率低，且許多重要的經濟植物目前尚未找到抗CMV基因，篩選獲得的新品種和品系多數對CMV耐病程度不同，而不是真正的抗病，在缺少抗源的情況下，通過這種方法很難選育出抗病新品種。
2.4利用基因工程技術，創(chuàng)造新的抗CMV種質資源
目前植物抗病毒基因工程主要包括3個領域，第1個領域是利用病毒本身的基因導入受體植物，獲得抗性植株，所獲得的抗性也稱病原起源的抗性（pathogen-derivedresistance）。這一領域的研究較多，已育成了不少抗性品種；第2、3個領域是分別利用植物中自然存在的抗性基因和植物、微生物的核糖體失活蛋白（RIPs）基因，獲得抗病毒植物。第1個領域又包括利用病毒外殼蛋白（coatrotein，CP）基因、病毒復制酶（replicase）基因、病毒運動蛋白（movementprotein，MP）基因、病毒反義RNA（antisenseRNA）、核酶（ribozyme）基因、病毒衛(wèi)星RNA（satelliteRNA）等方法介導病毒抗性。目前在抗CMV轉基因中利用較多的是CMVCP基因、CMV復制酶基因、CMV衛(wèi)星RNA、CMVMP基因介導抗性。
①CMVCP基因介導病毒抗性研究導入CMVCP基因是目前介導CMV抗性較為成功的一種方法。外殼蛋白是形成病毒顆粒的結構蛋白，其功能是包裹病毒的核酸（DNA或RNA），保護病毒核酸。20世紀50年代研究發(fā)現植物病毒具有交叉保護現象；20世紀70年代研究發(fā)現病毒外殼蛋白注入寄主體內具有抑制病毒侵染作用。人們從中得到啟示：病毒外殼蛋白可能在病毒侵染中起重要作用。1986年Beachy研究小組首先將煙草花葉病毒（TMV）的外殼蛋白基因導入煙草，培育出了抗TMV的煙草植株。目前國內外已有包括CMV在內的30多種病毒的外殼蛋白基因被導入多種植物中，并獲得了對病毒的抗性。我國科研工作者成功地將CMVCP基因導入番茄、西番蓮、甜椒、黃瓜等蔬菜作物，轉化的植株對CMV侵染表現出不同程度的抗性。
外殼蛋白介導抗性的作用機理可能有以下兩種情況：a.外殼蛋白包被理論。這是目前較為流行的理論。一種病毒感染植株后會復制產生大量外殼蛋白，使再次侵入的另一種病毒無法進行脫殼或脫殼后核酸被另一種外殼蛋白包被，從而干擾第二種病毒的復制；b.病毒外殼基因的RNA參與干擾病毒的復制。
通過導入病毒CP基因獲得的抗病植株，抗性常表現以下特點：a.抗性能力與CP蛋白的表達量呈正相關；b.抗性與接種的病毒濃度有關，高濃度病毒接種能克服CP介導的抗性；c.抗性只對病毒粒子起作用，一般不抗裸露的病毒RNA的攻擊。
②CMV復制酶基因介導病毒抗性研究 植物抗病基因工程另一個重大進展是利用病毒RNA復制酶基因的一部分轉化植物。非完整或非正常復制酶基因表達產物干擾了正常病毒的復制過程，導致病毒復制受到抑制和病毒基因非正常表達，使其無法繼續(xù)侵染和繁殖，這些是復制酶基因介導抗病性的主要原因。Anderson等將CMVFny株系的RNA2內部缺失94個核苷酸后利用農桿菌介導轉入煙草，獲得的轉基因植株對CMV表現高度的抗病性。謝響明用缺失的復制酶基因通過農桿菌介導轉化煙草和番茄品種，轉基因煙草、番茄對CMV表現較高的抗病性。利用病毒復制酶基因介導的抗性具有以下特點：a.對完整的病毒粒子和裸露的病毒RNA都具有高度的抗性；b.高濃度接種條件下抗性不變；c.抗病水平與基因整合的拷貝數無關；d.抗性持續(xù)時間長，而且對高溫不敏感；e.抗性具有較好的穩(wěn)定性和株系專化性。因而利用轉復制酶基因組分有望獲得高水平的抗CMV植株，其不足之處是抗性范圍過于狹窄。
③衛(wèi)星RNA介導病毒抗性研究衛(wèi)星RNA是獨立于病毒基因組之外，依賴于其輔助復制的小分子RNA。一般認為由衛(wèi)星RNA介導的抗病機制是衛(wèi)星RNA與病毒RNA競爭復制酶，從而干擾病毒基因組的復制，使表達衛(wèi)星RNA的轉基因植株抗病性得到提高。美籍印尼學者Kaper等在1976年首次發(fā)現CMV衛(wèi)星RNA。1986年，英國科學家Baulcombe把CMV的衛(wèi)星RNA轉成cDNA，再轉入煙草，第一次得到了抗CMV的轉基因植株，1989年我國學者吳世宣等也成功獲得了CMV衛(wèi)星RNA介導的抗CMV煙草。Harrison等（1987）將一個編碼CMV衛(wèi)星RNA的基因轉到了煙草植株基因組中，獲得抗CMV的轉基因植株。衛(wèi)星RNA介導抗性具有低水平衛(wèi)星RNA表達可起到抗病毒作用，不致于對植物產生危險的優(yōu)點，但是這種方法存在著一些缺陷：含有衛(wèi)星RNA的病毒種類少，大大限制了此法的應用范圍；衛(wèi)星RNA有良性和惡性之分，惡性可加重病癥，而且良性與惡性衛(wèi)星RNA的DNA序列同源性較高，同時衛(wèi)星RNA突變率高，良性易轉化為惡性；另外，衛(wèi)星RNA轉化的植株只是作物生長晚期抗病。
④CMVMP介導抗性研究進展植物病毒侵染宿主植物后在體內的運轉方式主要有兩種，一是通過植物維管組織進行的系統(tǒng)轉移，二是通過胞間連絲在細胞之間的移動。病毒在細胞間的移動是一個主動的過程，需要病毒編碼的蛋白參與，這種蛋白稱運動蛋白（movementprotein，MP）。運動蛋白可與胞間連絲相互作用，促進病毒在細胞間的轉移。如果能夠干擾或阻礙運動蛋白與胞間連絲的結合，就可以阻止病毒在植物體內的擴散，將侵入植物體內的病毒局限在最初的侵染部位，從而達到抗病毒的目的。為探討MP在促進病毒通過胞間連絲轉移中所起的作用，Cooper等將TMV編碼的30kD的運動蛋白（P30）完整編碼區(qū)及缺失了5′端的RNA結合區(qū)的突變基因導入煙草，發(fā)現轉完整P30基因的植株發(fā)病明顯快于對照植株，而轉缺失突變型P30基因的植株對病毒感染具很強的抵抗作用。后來的一些研究也表明，只有缺陷型或異源的MP才能介導轉基因植株對病毒的抗性；而有功能的完整MP或者對病毒侵染不起作用，甚至提高寄主對病毒的敏感性。張振臣等將4種不同缺失類型的Fny-CMV，MP基因導入煙草，其中含有N端缺失501個核苷酸的K130基因片段的轉基因煙草，對CMV表現較好抗性。
關于其抗病機理，一般認為轉基因植物缺失型MP和植物病毒正常的MP在寄主細胞的胞間連絲上有共同結合位點。轉基因植物中所表達的缺失型MP搶占了胞間連絲上的病毒MP的結合位點，病毒侵入植株后，正常的MP就失去了與胞間連絲結合的機會，從而阻礙了病毒在細胞間的移動。研究表明，MP基因介導的抗性具有廣譜性。MP轉基因植株不僅對MP基因來源病毒具有抗性，同時對其他一些病毒也具有抗性。如TMV部分缺失的MP基因轉基因煙草植株不僅對TMV產生抗性，對CMV、煙草脆裂病毒等也具有抗性。目前報道的MP基因介導抗病性的例子還不多，但隨著MP基因介導抗病性研究的深入，將有助于設計出更廣譜、更有效的抗病毒新策略。
2.5運用植物細胞工程技術結合理化誘變因子誘變篩選抗CMV突變體
植物組織和細胞培養(yǎng)技術的發(fā)展為在細胞水平上篩選抗病突變體提供了新的途徑。自從Carlson（1973）在煙草葉肉細胞原生質體和單細胞培養(yǎng)中，利用野火病毒誘變抗煙草野火病突變體以來，許多學者利用細胞培養(yǎng)技術結合理化誘變因子在許多作物上獲得了抗病突變體。王萬軍等利用60Co-γ射線照射花藥，經細胞培養(yǎng)獲得抗黃瓜花葉病毒的突變體植株。陳廷俊采用組織培養(yǎng)、化學誘變與病理學方法相結合，初步建立了一個煙草抗CMV細胞突變系篩選系統(tǒng)，并從普通煙草良種Burley18中篩選到抗CMV細胞突變系。這些嘗試為創(chuàng)造抗CMV種質資源提供了新的途徑。
3小結和展望
①藥劑防治主要切斷傳播途徑，由于污染環(huán)境和產品、危及人的健康，在生產應用上受到越來越多的限制。生物制劑、疫苗等由于其防治效果不穩(wěn)定、防效不明顯，應用范圍也很難擴大。
②由于自然界缺少CMV抗源，利用常規(guī)育種手段很難獲得真正的抗病新品種，育成的多是一些耐病品系，且由于常規(guī)育種的技術特點，育種需要的周期長，選擇效率低。
③基因工程技術由于具有可利用的基因資源豐富、育種周期短、抗性穩(wěn)定、不污染環(huán)境等優(yōu)點，在抗病育種中受到了普遍關注。通過植物基因工程技術的應用，基因資源的研究與常規(guī)育種技術相結合，可望培育出新一代抗病新品種。目前通過基因轉化技術已獲得了一批對CMV具有較好抗性的轉基因植株，為生產上減輕CMV的危害起到了一定的作用。
④運用植物細胞工程技術結合理化誘變因子誘變篩選抗CMV突變系，為短期、高效創(chuàng)造抗CMV突變系提供了有益的嘗試，但其預見性和成功率較差。
相信隨著生物技術的發(fā)展及其在抗病育種上的應用，CMV在生產上的危害必將得到有效的遏制。
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